일반적으로 광학 현미경(optical microscope)은 관찰하고자 하는 시편(specimen)에 광을 조사하여 영상(image)을 획득하는 도구로, 생체 의학 분야(biomedical field) 및 산업계(industrial field)에서 널리 활용되고 있다. 그러나 이러한 명시야 광학 현미경(bright field microscope)은 광량에 의한 영상을 획득하기 때문에, 광량 변화가 작은 생체 조직이나 세포와 같은 투명한 위상 시편(phase object) 등은 효과적으로 관찰할 수 없다는 한계를 가진다. 이를 극복하기 위해 개발된 위상차 현미경(phase contrast microscope)은 위상에 의한 시편의 밝기 변화를 통해 투명한 위상 물체를 보다 명확하고 뚜렷하게 관찰할 수 있다는 장점을 가진다^[1,2]. 그러나 이러한 위상차 현미경은 관찰되는 영상이 배경광(background intensity)과 혼합되어 나타나기 때문에 시편의 정량적 정보를 추출하기 어려우며, 또한 대부분 시편의 정확한 분석이 아닌 관찰 용도로 널리 활용된다.

한편, 광간섭(optical interference)을 이용한 정량적 위상 이미징 기술(quantitative phase imaging, QPI)^[3-5]은 위상차 현미경과는 달리 다양한 형태의 간섭계를 이용하여 시편의 독립적인 위상 영상(phase image)을 획득하며, 특히 디지털 홀로그래피(digital holography) 기술에 기반하여 실시간으로 위상 추출이 가능하다. 그러나 광학계의 구조상 마이켈슨(Michelson)^[3], 마흐-젠더(Mach-Zehnder)^[4], 사냑(Sagnac) 간섭계^[5] 등의 도입으로 인해 시스템이 다소 복잡해지고, 이로 인해 기존 현미경에 비해 안정성이 부족하다. 안정적인 광간섭 기반의 현미경 기술 중 미분 간섭 현미경(differential interference contrast microscope, DICM)은 현미경 내부에 Wollaston 프리즘이나 Nomarski 프리즘과 같은 복굴절 물질을 이용하여 시편에 미세한 광경로 차이를 발생시켜 간섭 신호를 획득하기 때문에 매우 안정적인 현미경을 구성할 수 있지만^[6-8], 기존의 미분 간섭 현미경은 주로 시편을 입체적으로 관찰하기 위한 용도로 활용되고 있으며 정량적인 위상 측정에 대한 연구는 다소 미흡한 상황이다.

본 연구에서는 층밀림 간섭계(lateral shearing interferometer) 기반의 정량적 위상 이미징을 위한 미분 간섭 현미경 모듈을 제안한다. 제안하는 모듈은 복굴절성(birefringence)과 편광 광 분할기(polarizing beam splitter)의 특성을 동시에 가지는 편광 격자(polarization grating)를 이용하여 매우 간단한 구조로 미분 간섭 현상^[9,10]을 발생시킬 수 있다. 또한, 편광 카메라(polarization camera)를 통해 획득되는 4개의 편광 영상으로 정량적인 위상차 영상뿐만 아니라 일반적인 명시야 현미경 영상을 동시에 추출할 수 있기 때문에, 시편의 다양한 정보를 한꺼번에 획득할 수 있다는 장점을 가지며, 일반적인 현미경에 쉽게 장착할 수 있다는 장점이 있다.

2.1. 편광 격자 및 층밀림 간섭 모듈

편광 격자는 그림 1(a)와 같이 얇은 유리판 위에 액정(liquid crystal)이 일정한 간격으로 배열되어 있어, 액정의 복굴절성 특성에 의해 위상 지연이 일어나며, 격자 구조의 배열로 인해 회절(diffraction) 및 편광 광분할이 복합적으로 일어난다^[9]. 이때, 편광 격자를 통과한 광은 그림 1(b)와 같이 입사 시 편광 상태에 따라 우원 편광(right-handed circular polarization, RHCP)의 경우에는 +1차로, 좌원 편광(left-handed circular polarization, LHCP)의 경우에는 −1차로 회절된다. 또한, 편광 격자는 λ/2 위상 지연판(half-wave plate)과 유사하게 입사하는 광의 원 편광(circular polarization) 상태를 이와 수직한 원 편광 상태로 변화시킨다. 따라서 입사하는 광이 선 편광(linear polarization)을 가지는 경우, 이는 우원 편광과 좌원 편광된 광으로 나누어 생각할 수 있으므로, 그림 1(c)와 같이 ±1차로 회절되는 2개의 서로 수직한 원 편광을 가지는 광이 발생한다^[9].

Figure 1. (a) Structure of a polarization grating (PG). LC, liquid crystal. (b) Characteristics of a polarization grating. (c) ±1^st-order diffracted beams at a polarization grating when a linearly polarized beam is incident. LP, linear polarization; LHCP, left-handed circular polarization; RHCP, right-handed circular polarization.

편광 격자의 이러한 특성을 이용하면, 그림 2(a)와 같이 입사 파면(wavefront)에 대한 층밀림 간섭 모듈을 구성할 수 있다. 광 분할기(beam splitter)와 선형 편광기(linear polarizer)를 통해 편광 격자에 광축으로 입사하는 광은 그림 1(c)에서와 같이 2개의 ±1차로 회절된 광으로 분리되며, 이후 거울에서 반사되면서 편광 상태가 서로 바뀐다. 즉, 우원 편광의 광은 거울에 반사되면서 좌원 편광의 광으로, 좌원 편광의 광은 우원 편광의 광으로 편광 상태가 바뀌고, 이후 2개의 광은 다시 편광 격자를 지나면서 처음과는 반대로 회절된다. 그래서 처음에 편광 격자에서 +1차로 회절된 광은 거울 반사 이후 −1차로 회절하면서 광축과 평행한 광으로 출사되며, 다른 하나의 광도 같은 원리로 광축과 평행하게 출사된다. 2개의 광은 처음에 편광 격자를 통해 ±1차로 회절되어 서로 다른 방향으로 진행했기 때문에 모듈에서 출사하는 2개의 광은 횡방향으로 분리되며, 층밀림량(s)은 편광 격자와 거울 사이의 거리(d)와 편광 격자의 1차 회절각(θ)에 의해 다음과 같이 나타낼 수 있다^[10].

Figure 2. (a) Optical configuration of the differential interference contrast microscope (DICM) module and (b) its photograph. (c) Example of the microscope system with the DICM module. BS, beam splitter; LP, linear polarizer; PG, polarization grating; M, mirror; PCMOS, polarization pixelated complementary metal-oxide-semiconductor camera.

제안하는 층밀림 간섭 모듈은 비록 편광 격자의 사양에 따라 θ가 결정되지만, d를 조절함에 따라 s를 유연하게 변화시킬 수 있다는 특징이 있기 때문에, 시편의 종류에 맞추어 시스템을 조절할 수 있다. 또한, 기준광(reference beam)과 측정광(measurement beam)이 공간적으로 분리되어 서로 다른 광학적 부품(optical component)을 통과하는 특징을 가지는 기존의 정량적 위상 이미징 광학계와는 달리, 제안하는 모듈에서는 간섭을 발생시키는 2개의 광이 모두 매우 짧은 공통 광경로를 가지기 때문에 진동 및 온도와 같은 환경 변화에 매우 둔감하다는 장점을 가진다.

2.2. 층밀림 간섭 모듈을 이용한 영상 획득

편광 격자를 이용하여 층밀림된 2개의 광은 서로 수직한 원편광을 가지고 있으며, 이러한 2개의 광을 광검출기로 편광 카메라를 이용하면 다음과 같이 4개의 위상 천이된 간섭 영상(phase-shifted interferogram)들을 획득할 수 있다.

여기서 I₀, I₄₅, I₉₀, I₁₃₅는 각각 편광 카메라 내부에 설치되어 있는 0°, 45°, 90°, 135°로 투과축이 회전되어 있는 편광기 배열을 통해 측정되는 편광 영상의 광강도(intensity)를 나타내며, I_B는 시편의 명시야 영상에 해당하는 광강도, γ는 간섭 무늬의 가시도(visibility)를 나타낸다. 식 (2)에서 ∆W_L는 층밀림 간섭으로 인해 발생한 측정 파면의 위상차(phase gradient)이며, 식 (2)를 통해 얻은 4개의 위상 천이된 광강도로부터 다음과 같이 계산할 수 있다^[11].

이와 더불어 식 (2)를 이용해 I_B와 γ를 다음과 같이 추출할 수 있다.

제안하는 편광 격자 기반의 미분 간섭 현미경 모듈은 식 (3)과 같이 정량적인 위상차 이미징이 가능하고, 식 (4), 식 (5)와 같이 명시야 영상과 광간섭 정도를 나타내는 가시도 영상을 한꺼번에 획득할 수 있다. 이는 기존의 현미경에서 단일 영상을 획득하는 기능과 차별되며, 이를 이용하면 시편의 특징을 보다 정량적, 가시적으로 측정 및 관찰할 수 있다.

3.1. 시편의 위상차 및 명시야 영상 측정

제안하는 시스템을 검증하기 위해 그림 2(b)과 같이 편광 격자 기반 미분 간섭 현미경 모듈을 구성하였다. 편광 격자로는 Edmund Optics사의 #12-677을 이용하였으며, 알루미늄 코팅 거울(PF10-03-G01; Thorlabs, NJ, USA)과 가시광 대역의 선형 편광기(WP25L-VIS; Thorlabs), 광분할기(CCM1-BS013M; Thorlabs)를 이용하였다. #12-677은 159 grooves/mm의 격자 간격을 가지고 있으며, 설계 파장은 550 nm이다. 이때, 구성한 모듈은 x 방향(가로 방향)으로 층밀림이 발생하도록 구성하였다. 한편, 편광 카메라로는 Teledyne FLIR사의 BFS-U3-51S5P-C를 이용하였으며, BFS-U3-51S5P-C는 (2,448 × 2,048)의 화소 분해능을 가지고 있다. 상기에 언급된 전체 광학 부품들을 하나의 소형 모듈로 구성하여, 그림 2(c)와 같이 일반적인 무한 보정 광학 현미경(infinity-corrected microscope) 구조에서 광검출기 대신 바로 부착할 수 있도록 적용의 편의성을 높였다. 이후, 이를 이용하여 다양한 시편의 영상을 획득하였다.

그림 3은 편광 격자 기반의 미분 간섭 현미경 모듈을 이용하여 획득한 시편의 영상을 나타낸다. 제작한 모듈은 2×의 배율을 가지는 반사형 현미경 시스템에 결합하였으며, 시편으로는 평면 거울을 이용하고, 거울 표면에 소량의 물을 뿌려 시간이 지남(1분 간격)에 따른 물의 증발 현상을 관찰하였다. 실험 결과, 그림 3과 같이 제안하는 시스템에서 명시야 영상 및 위상차 영상을 한번에 획득할 수 있음을 확인하였고, 이에 더하여 그림 3(a)의 명시야 영상과 달리 그림 3(b)의 위상차 영상에서 거울 표면의 물이 보다 명확하게 관찰되고 있음을 알 수 있었다. 이는 가시광 영역에서 물이 투명하기 때문에 명시야 영상에서는 물을 선명하게 확인할 수 없으나, 위상차 영상에서는 광이 물을 통과하면서 추가적인 광경로(optical path length)로 인한 위상차가 보다 분명하게 정량적으로 나타나기 때문이다.

Figure 3. (a) Bright field image and (b) phase contrast image of water bubble on a plane mirror surface over time by using the proposed differential interference contrast microscopic module.

또한, 추가적으로 컨택트 렌즈(eye contact lens)의 증발(evaporation)에 따른 관찰 실험을 수행하였다. 1.43–1.46의 굴절률을 갖는 투명한 시편인 소프트 컨택트 렌즈는 시간이 지남에 따라 시편 외부의 수분이 증발하고, 수분이 증발함에 따라 렌즈의 수축이 발생한다. 측정 결과, 그림 4와 같이 렌즈는 전체적으로 평평하게 펴져있는 최초 형상에서 시간이 지남에 따라 점진적으로 수축되었으며, 이는 명시야 영상에 비해 위상차 영상에서 더 명확하고 뚜렷하게 나타났다.

Figure 4. (a) Captured bright field images, (b) wrapped phase contrast images, and (c) unwrapped phase contrast images of an eye contact lens on a plane mirror during evaporation.

편광 격자 기반 미분 간섭 현미경 모듈을 50×의 배율을 가지는 투과형 현미경에 적용하여 생체 시편을 관찰하고, 시편에 대한 명시야 영상 및 위상차 영상을 획득하였다. 실험에서 사용한 생체 시편은 돼지의 간(한국과학기술원 유홍기 교수 연구실로부터 기증받은 시편)을 사용하였다. 시편을 측정한 결과 그림 5(a)의 명시야 영상에 비해 그림 5(b)의 위상차 영상에서 세포 및 혈관 등을 보다 분명하게 확인할 수 있었다. 이는 층밀림 간섭계의 원리상 시편의 위상 정보에 대해 위상 미분값을 획득하기 때문이다. 그러나 위상차 영상에서는 매우 높은 밀도로 위상이 접혀(wrapped) 있었으며, 이는 시편의 두께 및 표면이 사용한 광원의 파장(550 nm)에 비해 매우 두껍기 때문에 발생하였다.

Figure 5. (a) Captured bright field image and (b) phase contrast image of a pig liver.

3.2. 가독성 향상을 위한 시편의 영상 합성

본 연구에서 개발한 편광 격자 기반 미분 간섭 현미경 모듈은 한번의 측정으로 명시야 영상과 위상차 영상 및 간섭 정도를 나타내는 가시도 영상을 한번에 획득할 수 있다. 이러한 특징은 기존의 현미경과는 달리 3개의 서로 다른 영상으로 시편의 정보를 다양하게 획득할 수 있는 동시에 3장의 영상을 복합적으로 이용하여 가독성이 높은 시편 영상을 생성할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이를 위해 검증하기 위해 명시야 영상을 이용한 명암 대비, 위상차 영상을 통한 시편 위상 특징, 가시도 영상을 통한 시편의 특징을 동시에 두드러지게 나타내기 위한 복합 영상을 그림 6과 같이 구성하였다. 이러한 복합 영상은 다양한 형태로 3개의 영상을 조합하여 나타낼 수 있으며, 본 연구에서는 가시도 영상을 이용하여 임계값(threshold)을 설정하고 이를 통해 시편과 배경을 분리한 후, 명시야 영상과 위상 영상을 곱하는 방법으로 복합 영상을 생성하였다. 이러한 복합 영상은 비록 정량적인 시편의 정보를 추출하기 위한 목적은 아니지만, 실시간으로 시편에 대한 다양한 정보를 한번에 제공하는 것이 가능하기 때문에 기존의 현미경에 비해 편리하며, 3개의 영상 정보의 합성 가중치를 통해 각각의 영상 및 합성 영상 정보를 조절하는 것이 가능하다.

Figure 6. Composite image with three images (bright field image, phase contrast image, and fringe visibility image) measured by the proposed module.

편광 격자 기반 미분 간섭 현미경 모듈은 그림 2에서 보인 바와 같이 구성이 간단하여, 기존의 현미경 시스템에서 광검출기로 사용되는 CCD, CMOS 카메라 등의 일반 영상 장치를 대신하여 장착할 수 있다는 장점을 가진다. 본 연구에서는 반사형 및 투과형의 광학 현미경에 층밀림 간섭 모듈을 장착하여 실험을 진행하였다. 모듈의 안정성을 위해 편광 격자를 거울에 부착하여 하나의 광학 부품으로 사용하였으며, 광학 수차(optical aberration)를 최소화하기 위해 광분할기와 거울, 편광 카메라의 위치를 결정하고, 이들을 하나의 모듈로 구성하였다. 개발된 모듈은 시스템의 소형화 및 모듈화를 통해 그림 7과 같이 편리하게 기존의 현미경 시스템에 장착해 명시야 영상과 위상차 영상을 동시에 획득할 수 있다. 층밀림 모듈은 시편에 따라 x (가로) 혹은 y (세로) 방향으로 설치할 수 있으며, 이 경우 위상차 영상은 각 층밀림 방향에 따른 위상 정보를 가지게 된다.

Figure 7. Adaptability of the differential interference contrast microscope module to reflective and transmissive microscopes. BS, beam splitter; LP, linear polarizer; PG, polarization grating; M, mirror; PCMOS, polarization pixelated complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) camera; OL, objective lens; TL, tube lens; L, lens; S, specimen.

본 연구에서는 편광 격자 기반의 층밀림 간섭 현미경을 이용하여 투명 위상 시편에 대한 명시야, 위상차 영상을 획득하고 시편을 관찰하는 연구를 수행하였다. 그러나 그림 5와 그림 6과 같이 시편의 위상차가 큰 경우, 위상차 영상에서 시편의 위상 변화를 확인할 수는 있으나 그 양상이 비교적 불규칙하였으며 위상이 접히는 현상이 발생하였다. 이는 생체 시편의 크기와 형태가 불분명하며 굴절률 또한 일정하지 않아 발생한 것으로, 시편의 정보를 정확하게 분석하는 데에 한계가 있음을 의미한다. 이를 극복하기 위해서는 시편을 준비하는 과정에서 시편에 대한 기본적인 정보 제공이 필요하며, 이러한 정보를 통해 위상차 영상을 분석하는 과정이 필요하다.

본 연구에서는 층밀림 간섭계 기반의 정량적 위상 이미징을 위한 미분 간섭 현미경 모듈을 개발하였다. 제안하는 모듈은 편광 격자를 이용하여 매우 간단한 구조로 간섭계를 구성하고, 편광 카메라를 이용하여 명시야 영상, 위상차 영상, 가시도 영상을 동시에 추출하였다. 또한, 제안하는 모듈은 일반적인 현미경에 쉽게 장착될 수 있는 장점이 있는 동시에 추출한 영상들로부터 보다 가독성이 높은 합성 영상 구성이 가능하였다. 제안하는 모듈의 성능을 검증하기 위해 반사형 및 투과형 현미경에 개발한 모듈을 장착하여 실험을 수행하였으며, 다양한 시편들에 대한 영상 및 정량적 위상 측정 결과를 제시하였다.

여러 생체 시편을 제공해준 Biomedical Optics and Optical Metrology Lab., Dept. of Mechanical Engineering, KAIST의 유홍기 교수님께 감사드립니다.

저자들은 본 연구와 저자됨, 논문출판에 관련된 어떤 경제 지원도 공식적으로 받지 않았음을 밝힌다.

저자는 본 논문과 관련된 어떠한 이해충돌 사항도 없었음을 밝힌다.

본 연구의 결과 분석 및 생성된 데이터는 모두 본 논문 내 명시되어 있으며 공공의 이용이 불가능하다. 데이터에 접근하거나 사용하고자 하는 이는 저자에게 타당한 이유를 밝히고 허가를 득해 사용 가능하다.