기존 유전학 기술은 특정 유전자나 세포의 기능을 연구하는 데 중요한 도구로 사용되어 왔지만, 시간적·공간적 제어의 한계로 인해 신경 회로와 세포 기능을 정확히 이해하는 데 어려움이 있었다. 특히 신경 세포의 활동을 정밀하게 조절하기 어렵고, 세포의 활성화나 억제의 실시간 관찰에 한계가 존재한다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 등장한 광유전학(optogenetics)은 빛을 이용하여 특정 신경 세포를 밀리초 단위로 정밀하게 제어할 수 있는 기술이다. 광유전학 기술의 구체적인 예시로는 유전공학적 방법을 통해 빛에 반응하는 채널로돕신-2 (channelrhodopsin-2, ChR2) 단백질을 특정 신경 세포에 발현시킴으로써 신경 세포의 활동을 빛을 이용하여 비침습적으로 조절하는 기술이 있다^[1]. 광유전학적 방법으로 특정 신경 세포를 자극하게 되면, 기존의 전기적 자극 혹은 약물을 이용한 신경 제어 방식과 비교하여 더 정밀한 시공간적 제어가 가능하다. 이를 통해 신경 회로의 기능을 정확히 분석하고, 신경계 질환의 메커니즘을 실시간으로 연구할 수 있다. 예를 들어, 뇌의 특정 영역에 자극을 가하면서 나타나는 변화를 관찰함으로써 해당 신경 회로가 어떤 역할을 하는지, 뇌의 어느 영역과 신경 회로가 연결되어 있는지 파악할 수 있다. 나아가, 특정 신경 회로의 이상으로 나타나는 신경 질환에서 해당 회로의 신경을 광유전학적으로 자극하여 회로를 조작함으로써 질환의 원인을 파악하고 그에 맞는 치료법을 개발할 수 있다. 이처럼 광유전학의 등장은 뇌와 행동의 관계를 이해하는 데 중요한 돌파구를 제공하고 있다.

광유전학 기술로 세포 활동을 제어하면 빛 자극을 받은 세포가 활동하면서 만들어 내는 이온의 흐름에 의해 전기생리학 신호가 발생하고, 이 신호는 신경 탐침을 통해 기록할 수 있다. 현재 주로 사용되는 신경 탐침의 종류로는 금속이나 실리콘과 같이 단단한 소재로 이루어져 있는 다중 전극 배열 형태의 삽입형 탐침과^[2-4], 고분자 물질과 같이 유연한 소재로 제작된 표면 전극 배열 형태의 신경 탐침이 있다^[5-8]. 삽입형 탐침은 미세한 뇌신경 신호를 감지하기 위해 단단한 소재의 탐침이 직접 뇌에 삽입되기 때문에 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio, SNR)가 높다는 장점이 있지만, 탐침이 매우 딱딱하여 뇌에 삽입되었을 때 뇌세포를 손상시키고 세포 주변에 면역 반응을 일으켜 장시간 뇌의 신경 신호를 측정하기 힘들다는 단점이 존재한다^[9,10]. 반면, 표면 전극 배열 형태의 신경 탐침의 경우 뇌에 직접 삽입하는 대신 뇌의 표면에 부착해 신경 신호를 측정하기 때문에 뇌에 직접적인 손상을 주지 않지만, 탐침을 구성하는 소재의 유연성 및 두께의 한계 때문에 단일 신경 신호를 감지하는 성능이 떨어진다는 단점이 있다^[9,11]. 이러한 문제점들을 해결하기 위해 뇌의 손상을 최소화하면서도 동시에 신경신호 감지 능력이 뛰어난 새로운 유형의 신경 탐침 기술이 필요한 상황이다.

본 논문에서는 광유전학 기술을 이용하여 세포의 활동을 제어하면서 그에 따른 전기생리학 신호를 기록할 수 있도록 개발된 새로운 신경 탐침인 NeuroWeb에 대해 소개하고자 한다^[12]. NeuroWeb은 표면 전극 배열 형태의 신경 탐침으로서 뇌에 직접적인 손상을 주지 않고, 이차원 물질을 활용하여 탐침의 두께를 100 nm까지 줄임으로써 기존의 표면 전극 배열 탐침의 단점을 보완한 새로운 신경 탐침이다. 또한 가시광선 영역에서 매우 높은 빛 투과율을 보이므로, NeuroWeb을 활용하면 탐침으로 인해 발생하는 방해 없이 광유전학적 방법으로 세포 활동을 제어함과 동시에 뉴런 신호를 정밀하게 측정할 수 있다. 본 논문은 이러한 NeuroWeb의 차별점들을 바탕으로 진행한 광유전학 신경 회로의 분석 예시에 대해 집중적으로 소개할 것이다.

NeuroWeb은 매우 얇은 이차원 물질인 그래핀(graphene, Gr)과 육방정계 질화 붕소(hexagonal boron nitride, h-BN)를 사용하여 개발되었으며, 두께가 100 nm에 불과하여 지금까지 보고된 탐침 중 가장 얇은 새로운 신경 탐침이다^[12]. NeuroWeb은 크게 활성 영역, 지지 영역, 금속 연결부로 구성되어 있으며, 활성 영역과 지지 영역은 개방형 격자 구조로 이루어져 있다[그림 1(a)]. 활성 영역에는 백금(Pt)/금 접합부(Au joint)/백금(Pt) 층으로 이루어진 32개의 Pt 전극이 h-BN 절연층으로 감싸인 그래핀과 연결되어 있는데[그림 1(b)], 이 Pt 전극은 신경 신호의 감지를 위해 격자 구조 밖으로 노출되어 있다. 총 두께 약 100 nm가량의 활성 영역은 h-BN/Gr/h-BN 구조 위에 안정성을 위해 얇은 SU-8 층이 올라간 구조로 이루어져 있으며, SU-8/Au/SU-8 층의 개방형 격자 구조로 구성된 지지 영역과 연결되어 있어 활성 영역이 뇌 표면에 부착될 때 엉키거나 주름이 생기지 않도록 한다. 한편 Au로 이루어진 금속 연결부는 활성 영역의 그래핀과 input/output (I/O) 패드를 연결해 주고, I/O 패드는 최종적으로 flexible flat cable (FFC)을 통해 외부 기록 장치에 연결된다. 이때 지지 영역과 금속 연결부의 두께는 약 1 µm이다.

Figure 1. Design of NeuroWeb. (a) Schematic illustration of NeuroWeb on the mouse brain surface. NeuroWeb consists of the active region, supporting region, and metal interconnects. (b) Close-up view of the active region in (a) (black dashed box), which consists of the Pt recording electrode (gray), Au joint (yellow), Gr line (black), top and bottom h-BN insulating layers (green), and SU-8 (light blue). Reprinted from J. M. Lee et al. Nat. Commun. 2023; 14; 7088. Copyright ⓒ 2023, J. M. Lee et al.^[12].

NeuroWeb의 활성 영역은 모두 얇은 이차원 물질로 구성되어 있기 때문에, 가시광선 영역에서 높은 투과율을 보인다는 광학적 특성을 가지고 있다. 실제로 쥐 뇌의 표면에 NeuroWeb을 부착했을 때 h-BN과 그래핀의 뛰어난 투명성 덕분에 활성 영역 아래의 뇌 표면 및 혈관을 명확하게 관찰할 수 있었으며[그림 2(a)], 고배율로 촬영한 사진에서도 활성 영역의 Pt 전극만이 관측되었다[그림 2(b), 흰색 화살표]. 가시광선 파장 범위(480–780 nm)에 걸쳐 NeuroWeb 내 활성 영역의 투과율을 측정한 결과에서도 측정한 모든 파장대에 걸쳐 균일하고 높은 투과율을 보였으며, 평균 투과율은 96%로 나타났다[그림 2(c)]. 이 결과는 NeuroWeb의 광유전학적 활용 가능성을 뒷받침하며, 특히 복잡한 신경 활동의 동시다발적인 광유전학 및 전기생리학적 측정 가능성을 입증한다.

Figure 2. Optical properties of NeuroWeb. (a) Optical image of the NeuroWeb active region (black dashed lines), which is well-attached to the brain surface. Scale bar, 1 mm. (b) Magnified image of the white dashed box in (a). Seven electrodes (white arrows) are visible, whereas the transparent h-BN/Gr ribbons are not visible to the naked eye. Scale bar, 100 µm. (c) Measured transmittance of the h-BN/Gr/h-BN ribbon over a wide visible wavelength range (480–780 nm). Reprinted from J. M. Lee et al. Nat. Commun. 2023; 14; 7088. Copyright ⓒ 2023, J. M. Lee et al.^[12].

NeuroWeb의 뛰어난 투명성을 바탕으로 광유전학 실험과 전기생리학적 신호 측정을 동시에 진행하여 뇌의 신경 회로를 분석할 수 있다^[12]. 예를 들어, 체성감각 피질(somatosensory cortex, S1) (ML: 3.4, AP: −2.3, DV: 1.1)과 소뇌(cerebellum, Cb) (ML: 0, AP: −6.3, DV: −0.9)의 표면에 각각 NeuroWeb을 부착하고, 한 영역에 레이저를 사용하여 빛 자극을 주면서 전기생리학적 신호를 동시에 측정하면 두 영역 사이에 전달되는 신경 신호를 확인할 수 있다[그림 3(a)]. 광유전학 실험을 위해, 청색광에 반응하는 채널로돕신-2 단백질이 발현되도록 유전자 변형된 쥐의 체성감각 피질과 소뇌에 두 개의 서로 다른 NeuroWeb A와 B를 각각 부착하고, 체성감각 피질 또는 소뇌에 가해지는 488 nm 파장의 레이저 자극에 의해 발생한 신경 신호를 기록하였다[그림 3(b)]. 이때 두 NeuroWeb을 뇌 표면에 부착하기 위해 체성감각 피질과 소뇌 위의 두개골 및 경막을 약 3 mm × 3 mm 크기로 제거하였다. 각 NeuroWeb의 I/O 패드는 direct contact method를 사용하여 32채널 FFC (FFC-A 또는 FFC-B)에 연결하고, 광섬유와 연결된 레이저 다이오드로 체성감각 피질 혹은 소뇌를 선택적으로 자극하였다[그림 3(c)]. 488 nm 파장의 레이저 다이오드는 함수 발생기에 연결하여 주파수 10 Hz, 폭 5 ms의 펄스 신호를 생성하도록 하였고, 동시에 함수 발생기를 신경 신호를 기록하는 장치에도 연결하여 빛 자극과 신경 신호가 측정되는 시간을 동기화하였다. 이 실험을 통해 서로 다른 중추 신경계 영역인 체성감각 피질과 소뇌에서 빛 자극에 의해 유발되는 신경 활동 및 두 영역 간의 신경 회로를 확인할 수 있었다.

Figure 3. Optical stimulation. (a) Schematic of the optogenetics experiment. NeuroWebs A and B are placed on the surfaces of S1 (somatosensory cortex) and Cb (cerebellum), respectively, with one of them stimulated by a 488 nm laser. (b) Optical microscope image of the S1 and Cb of a live transgenic mouse with NeuroWebs A and B. Scale bar, 1 mm. (c) Photograph of optical stimulation to the brain of a live mouse using a fiber-coupled laser diode (pulse width: 5 ms, period: 10 Hz). Two NeuroWebs with 32 Pt electrodes are electrically connected to FFC-A and FFC-B via I/O pads. Scale bar, 1 cm. Reprinted from J. M. Lee et al. Nat. Commun. 2023; 14; 7088. Copyright ⓒ 2023, J. M. Lee et al.^[12].

체성감각 피질 위에 부착된 NeuroWeb A와 소뇌 위에 부착된 NeuroWeb B로부터의 전기생리학적 신호를 측정한 결과, 다음과 같은 특징들이 확인되었다(그림 4). 첫째, 마취 상태에 빠진 쥐는 신경 활동이 억제되었기 때문에 NeuroWeb A와 B의 채널에서 자발적인 신경 활동이 거의 측정되지 않았다. 둘째, 빛 자극을 가하는 영역에서는 레이저 펄스와 동기화된 신경 신호가 측정되었다. 예를 들어, 소뇌를 레이저로 자극할 때 NeuroWeb B에서는 레이저 펄스가 가해지는 순간에만 신경 신호가 관찰되었다[그림 4(a), 빨간색 trace]. 자극을 받는 신경 근처의 전극에서 더 강한 신호가 감지되었고, 레이저 펄스 신호와 자극에 의해 나타난 신경 신호 간의 시차는 없었다. 셋째, 자극을 가하지 않은 다른 영역에서도 신경 신호가 감지되었다. 일례로 소뇌(NeuroWeb B)를 자극할 때, 체성감각 피질(NeuroWeb A)에서 소뇌에 가해진 레이저 펄스와 동일한 주기의 신경 신호가 일정한 시간 지연을 가지고 관측되었다[그림 4(a), 검은색 trace]. 이때 자극을 가하지 않은 영역에서 측정된 신경 신호를 확인하기 위해, 소뇌 또는 체성감각 피질의 신경을 자극하는 동안 NeuroWeb A와 B에서 측정된 신호를 분석하였다[그림 4(b), 4(c)]. 먼저 소뇌를 레이저로 자극할 때, 소뇌에 부착된 NeuroWeb B에서 빛에 의한 자극으로 나타난 신경 신호가 레이저 펄스와 동시에 나타났고[그림 4(b), 빨간색 trace], 그로부터 수 밀리초 후에 NeuroWeb A에서 체성감각 피질의 신경 신호가 감지되었다[그림 4(b), 검은색 trace]. 반대로 체성감각 피질이 레이저로 자극될 때, NeuroWeb A(체성감각 피질, 검은색 trace)와 NeuroWeb B(소뇌, 빨간색 trace)에서도 각각 빛 자극에 의해 유발된 신경 신호와 그로부터 수 밀리초 지연 후 나타나는 반응 신호가 관찰되었다[그림 4(c)]. 이는 체성감각 피질과 소뇌가 신경 회로를 통해 상호 소통하고 있음을 보여준다.

Figure 4. Filtered traces of optical stimulation experiment. (a) Band-pass filtered (250–6,000 Hz) extracellular spike recordings from the S1 (NeuroWeb A, black traces) and the Cb (NeuroWeb B, red traces), when the Cb is optically stimulated. The blue line indicates the voltage pulses applied to the laser diode (top). (b) and (c) Representative band-pass filtered extracellular spike recordings from the S1 (NeuroWeb A, black traces) and the Cb (NeuroWeb B, red traces). A pulsed laser (blue line) optically stimulates the Cb (b) or S1 (c). The dotted lines are added to display the time difference between the evoked and responded spikes (★). Reprinted from J. M. Lee et al. Nat. Commun. 2023; 14; 7088. Copyright ⓒ 2023, J. M. Lee et al.^[12].

더 정밀한 분석을 위하여 추가로 몇 가지 통계적 분석을 수행하였다. 먼저 레이저 자극의 전력 밀도를 조절하여 전력 밀도에 따른 신호 변화를 관찰해 보았다. 그 결과, 1.30 mW/mm² 이상의 레이저 전력 밀도에서는 자극에 의한 신호가 관찰된 반면, 더 낮은 전력 밀도에서는 신호가 관찰되지 않았다. 또한 레이저의 전력 밀도가 P1: 1.30 mW/mm², P2: 1.43 mW/mm², P3: 1.59 mW/mm²로 점차 증가해도 신경 신호의 진폭에는 유의미한 차이가 없었다[그림 5(a)]. 이에 더해 레이저의 전력 밀도가 신경 신호의 진폭에 영향을 주지 않았음을 통계적으로 확인하기 위하여 P1과 P2, 그리고 P1과 P3 전력 밀도로 측정한 결과들끼리 각각 two-sided t-test를 진행하였다. 그 결과, 전력 밀도가 P1, P2일 때와 P1, P3일 때의 측정값 사이에서 얻은 P값이 각각 0.90과 0.55였다. 통상적으로 two-sided t-test에서 P값이 0.05를 초과하는 경우 조작한 변인이 측정값에 통계적으로 유의미한 영향을 미치지 못한다고(not significant) 해석되므로, 통계적으로도 레이저의 전력 밀도가 신경 신호의 진폭과 관련 없음을 확인할 수 있다. 따라서 레이저 전력 밀도의 증가에 따른 신경 신호의 진폭 변화가 크게 없는 것은 측정된 신호가 빛이나 전기 신호 등 외부 요인에 의해 발생한 것이 아닌 신경 세포의 활동으로부터 측정된 신호임을 의미한다.

Figure 5. Statistical analysis of optical stimulation experiment. (a) Spike amplitudes recorded in NeuroWeb A with increasing laser power densities (P1: 1.30, P2: 1.43, and P3: 1.59 mW/mm²). Boxplots show mean (squares), median (horizontal lines), quartiles (boxes, 25–75%), and range (whiskers, 1–99%). P = 0.90 and P = 0.55 (two-sided t-test). NS, not significant. (b) Peak-to-peak latency between the evoked and responded spikes in the pathways from the S1 to Cb (A → B, black dots) and from the Cb to S1 (B → A, red dots). Boxplots show mean (squares), median (horizontal lines), quartiles (boxes, 25–75%), and range (whiskers, 1–99%). (c) Schematic of the neural circuits between the S1 and Cb^[19]. PN, pontine nuclei; Th, thalamus. Reprinted from J. M. Lee et al. Nat. Commun. 2023; 14; 7088. Copyright ⓒ 2023, J. M. Lee et al.^[12].

실제로 가해진 레이저의 전력 밀도가 신경 세포를 자극하기에 충분한지 알아보기 위해, 레이저의 전력 밀도에 따라 자극되는 신경 세포의 개수가 어떻게 달라지는지 이론적으로 계산해 보았다. 먼저 레이저를 가할 시 채널로돕신-2 (ChR2)의 활성화 임계값(1 mW/mm²)보다 큰 전력 밀도의 청색광을 받는 세포만 자극된다고 가정하였다^[13]. 쥐 뇌에 가한 레이저의 전력 밀도는 각각 1.30, 1.43, 1.59 mW/mm²였으며, 빛의 에너지 밀도는 뇌 조직의 깊이에 따라 지수적으로 감소하기 때문에^[14,15], 자극을 받은 영역의 깊이는 각각 약 0.02, 0.03, 0.04 mm까지로 추정된다. 이는 쥐 뇌의 첫 번째 피질 층까지만 빛에 의해 자극되었음을 의미한다^[16]. 다음으로, 자극된 신경 세포의 수를 추정하기 위해 빛을 가해 준 부분의 면적(~0.5 mm²)을 위에서 언급한 자극된 영역의 깊이와 곱하여 자극된 영역의 부피를 계산하였다. 그 결과 레이저 전력 밀도가 각각 1.30, 1.43, 1.59 mW/mm²일 때 자극된 영역의 부피는 각각 0.01, 0.015, 0.022 mm³로 추정되었다. 체성감각 피질의 첫 번째 피질 층과 소뇌의 분자층에서의 신경 세포 밀도는 각각 ~29,213개/mm³, ~14,000개/mm³인 것으로 알려져 있으므로^[17,18], 레이저 전력 밀도가 1.30, 1.43, 1.59 mW/mm²일 때 체성감각 피질에서는 각각 292, 438, 584개의 신경 세포가, 소뇌에서는 각각 140, 210, 280개의 신경 세포가 자극된 것으로 추정된다.

추가로 NeuroWeb A와 B에 기록된 빛 자극에 의해 유발된 신호와 지연되어 나타나는 반응 신호 간의 시간 차이에 대한 정량적 분석을 수행하였다. 총 세 마리의 쥐에서 측정된 유발 신호와 반응 신호 간의 시간 차이를 평균 내어 보면, 체성감각 피질에서 소뇌로 전달되는 신경 신호의 진폭이 최대가 되는 지점 간 평균 시간 지연은 6.33 ± 0.50 ms, 소뇌에서 체성감각 피질로 전달되는 신경 신호의 진폭이 최대가 되는 지점 간 평균 시간 지연은 5.88 ± 0.20 ms로 나타났다[그림 5(b)]. 체성감각 피질에서 발생한 신경 신호는 교뇌핵(pontine nuclei)을 거쳐 소뇌로 전달되고, 소뇌에서 발생한 신경 신호는 시상(thalamus)을 거쳐 체성감각 피질로 전달된다^[19]. 따라서 두 경로에서 나타나는 평균 약 0.45 ms의 시간 차이는 체성감각 피질에서 교뇌핵을 거쳐 소뇌로 이어지는 경로가 소뇌에서 시상을 거쳐 체성감각 피질로 이어지는 경로보다 신경 신호 전달에 필요한 시간이 조금 더 오래 걸린다는 것을 나타낸다[그림 5(c)].

이러한 발견은 NeuroWeb이 뇌의 주름진 표면에도 잘 부착되어 신경 활동을 높은 시간 해상도(0.05 ms)로 측정할 수 있었기 때문에 가능했다. 또한 NeuroWeb의 높은 투과율 덕분에 탐침에 의한 방해 없이 광유전학 실험을 성공적으로 수행할 수 있었다. 이러한 예시와 같이 NeuroWeb과 광유전학 기술을 활용하면 보다 복잡한 신경 회로의 활동도 실시간으로 추적할 수 있을 것이다.

본 논문에서는 광유전학을 활용한 신경 자극 기술과 실제 응용 예시에 대해 정리하였다. 특히 이차원 물질로 이루어진 매우 얇고 투명한 신경 탐침 NeuroWeb에 대해 소개하고, NeuroWeb을 활용한 광유전학 실험 사례를 상세히 소개하였다. NeuroWeb은 뛰어난 투명성 덕분에 탐침에 의한 방해 없이 레이저를 통한 신경 세포의 자극이 가능하며, 이를 통해 체성감각 피질과 소뇌 사이의 신경 회로를 분석하여 신경 신호의 전달 경로와 시간 지연을 정량적으로 분석할 수 있었다.

이러한 예시를 통해 NeuroWeb이 높은 투명도를 바탕으로 신경 회로를 실시간으로 분석할 수 있는 강력한 도구임을 보이고, 특히 광유전학 기술과 결합할 시 복잡한 신경 회로와 신경 활동을 더욱 정밀하게 연구할 수 있는 도구가 될 수 있다는 가능성을 제시하였다. 이를 활용하면 신경계 질환에서 특정 회로의 기능적 손상이 어떻게 나타나는지 연구함으로써 질환의 증상을 완화하거나, 질병의 진행을 늦출 수 있는 치료 전략을 개발할 수 있을 것이다. 향후 NeuroWeb과 같은 신경 탐침이 신경과학 연구 및 알츠하이머, 파킨슨병과 같은 신경계 질환의 치료에 중요한 기여를 할 수 있을 것으로 기대한다.

한국연구재단 중견연구(Grant No. 2021R1A2C3006781).

저자는 본 논문과 관련된 어떠한 이해충돌 사항도 없었음을 밝힌다.

본 연구의 결과 분석 및 생성된 데이터는 모두 본 논문 내 명시되어 있으며 공공의 이용이 가능하다. 데이터에 접근하거나 사용하고자 하는 이는 저자에게 타당한 이유를 밝히고 허가를 득해 사용 가능하다.